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激光共聚焦顯微鏡的原理與應用范圍

文字:[大][中][小] 2014-8-5    瀏覽次數:2459    

激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源,在傳統光學顯微鏡基礎上采用共軛聚焦原理和裝置,并利用計算機對所觀察的對象進行數字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統。把光學成像的分辨率提高了30%~40%,使用紫外或可見光激發熒光探針,從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像,在亞細胞水平上觀察生理信號及細胞形態的變化,成為形態學,分子生物學,神經科學,藥理學,遺傳學等領域中新一代的研究工具。

1激光掃描共聚焦顯微鏡的原理

從基本原理上講,共聚焦顯微鏡是一種現代化的光學顯微鏡,它對普通光鏡從技術上作了以下幾點改進:

1.1用激光做光源因為激光的單色性非常好,光源波束的波長相同,從根本上消除了色差。

1.2采用共聚焦技術在物鏡的焦平面上放置了一個當中帶有小孔的擋板,將焦平面以外的雜散光擋住,消除了球差;并進一步消除了色差

1.3采用點掃描技術將樣品分解成二維或三維空間上的無數點,用十分細小的激光束(點光源)逐點逐行掃描成像,再通過微機組合成一個整體平面的或立體的像。而傳統的光鏡是在場光源下一次成像的,標本上每一點的圖像都會受到相鄰點的衍射光和散射光的干擾。這兩種圖像的清晰度和精密度是無法相比的。

1.4用計算機采集和處理光信號,并利用光電倍增管放大信號圖

在共聚焦顯微鏡中,計算機代替了人眼或照相機進行觀察、攝像,得到的圖像是數字化的,可以在電腦中進行處理,再一次提高圖像的清晰度。而且利用了光電倍增管,可以將很微弱的信號放大,靈敏度大大提高。由于綜合利用了以上技術。可以說LSCM是顯微鏡制作技術、光電技術、計算機技術的完美結合,是現代技術發展的必然產物。

2激光掃描共聚焦顯微鏡在生物醫學研究中的應用

目前,一臺配置完備的LSCM在功能上已經完全能夠取代以往的任何一種光學顯微鏡,它相當于多種制作精良的常用光學顯微鏡的有機組合,如倒置光學顯微鏡、紫外線顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡(PH)、微分干涉差顯微鏡(DIC)等,因此被稱為萬能顯微鏡,通過它所得到的精細圖像可使其他的顯微鏡圖像無比遜色。

2.1觀察活細胞、活組織LSCM在不損傷細胞的前提下,對活組織、活細胞進行觀察和測量,這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程(如脫水、脫蠟、染色等);而且觀察過的樣品還可以繼續用于其他的研究。這種功能對于細胞培養、轉基因研究尤為重要。這可以說是LSCM最大的優勢。

2.2生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針,對于要檢測的成分不僅可以定位到細胞水平,還可以定位到亞細胞水平和分子水平

2.3動態觀察在同一樣品平面上隨時間進行連續掃描,就可分析細胞結構、內含、和標記等動力學變化。目前在這方面做得最多的是使用LSCM觀察心肌或平滑肌細胞內游離鈣、鈉、鉀離子濃度或PH的動態變化。

2.4數據、圖像的數字化用計算機代替了普通的照相機,得到的圖像是數字化的,可及時輸出或長期儲存,而且還可進一步加工處理。

2.5定量測量首先應用專一的熒光探針對樣品進行染色,樣品的熒光強度和所測成分的含量呈正比,如果其余條件固定,通過對比各組樣品之間的熒光強度值,可得出特定成分的含量比。

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